Zadanie 13
Matura z biologii, maj 2023, poziom rozszerzony
Wymaganie: XV. Biotechnologia. Podstawy inżynierii genetycznej. Zdający: 3) przedstawia narzędzia wykorzystywane w biotechnologii molekularnej (enzymy: polimerazy […]) i określa ich zastosowania; 4) przedstawia istotę technik stosowanych w inżynierii genetycznej ([…] metoda PCR […]).
I. Chemizm życia. 2. Składniki organiczne. Zdający: 4) porównuje skład chemiczny i strukturę cząsteczek DNA i RNA […].
IV. Podziały komórkowe. Zdający: 2) wyjaśnia mechanizm replikacji DNA, z uwzględnieniem roli enzymów ([…] polimeraza DNA […]).
Treść zadania
Na poniższym schemacie przedstawiono przebieg pierwszego cyklu amplifikacji DNA metodą PCR. Uwzględniono tylko dwa z czterech deoksyrybonukleotydów niezbędnych do syntezy DNA.
Uwaga: deoksyrybonukleotydy oznacza się czteroliterowymi skrótowcami, np. trifosforan deoksyguanozyny – dGTP (ang. deoxyguanosine triphosphate).
Schemat: dwuniciowy DNA → ETAP 1. rozdzielenie nici DNA → ETAP 2. przyłączenie starterów → ETAP 3. synteza DNA, z udziałem: + polimeraza DNA, + dGTP, + dTTP, + .........., + ..........
Na podstawie: B. Alberts i in., Podstawy biologii komórki, Warszawa 2016.
Zadanie 13.1. (0–1)
Uzupełnij powyższy schemat – wpisz w wyznaczone miejsca (+ ..........) oznaczenia dwóch deoksyrybonukleotydów niezbędnych do syntezy DNA, brakujących na schemacie.
Zadanie 13.2. (0–1)
Określ, w jaki sposób przeprowadza się rozdzielenie dwuniciowego DNA podczas pierwszego etapu każdego cyklu PCR.
Zadanie 13.3. (0–1)
Wyjaśnij, dlaczego w cyklu PCR etap syntezy DNA musi być poprzedzony przyłączeniem starterów. W odpowiedzi uwzględnij właściwości polimerazy DNA.
Źródło: arkusz CKE MBIP-R0-100-2305. Otwórz oryginalny PDF
Rozwiązanie
13.1. Brakujące deoksyrybonukleotydy:
- dATP (deoksyadenozyno-trifosforan)
- dCTP (deoksycytydyno-trifosforan)
Razem z dGTP i dTTP (podane na schemacie) tworzą komplet 4 deoksyrybonukleotydów niezbędnych do syntezy DNA: A, T, G, C.
Uzasadnienie: nić DNA składa się z 4 zasad (A, T, G, C). Polimeraza DNA dobiera nukleotydy komplementarne do matrycy:
- A na matrycy → wbudowanie dTTP (komplementarna do A).
- T na matrycy → wbudowanie dATP.
- G na matrycy → wbudowanie dCTP.
- C na matrycy → wbudowanie dGTP.
Brak choćby jednego z czterech zatrzymałby syntezę (gdy polimeraza dochodzi do miejsca wymagającego brakującego nukleotydu).
13.2. Rozdzielenie dwuniciowego DNA podczas etapu 1 każdego cyklu PCR zachodzi przez denaturację termiczną (podgrzanie próbki):
- Próbka podgrzana do ~94-95°C przez ~30 sekund.
- Wysoka temperatura rozrywa wiązania wodorowe między komplementarnymi parami zasad (A-T: 2 wiązania, G-C: 3 wiązania).
- Wiązania kowalencyjne (fosfodiestrowe szkieletu) pozostają nienaruszone — nici nie rozkładają się, tylko rozdzielają.
- Powstają 2 jednoniciowe matryce DNA, gotowe do przyłączenia starterów.
Zasady oceniania uznają też rozdzielenie nici za pomocą helikazy (PCR w warunkach izotermicznych). Nie uznają odpowiedzi „dzięki zmianom temperatury” (bez kierunku zmiany) ani samego „przez denaturację” (tautologia).
13.3. Synteza DNA musi być poprzedzona przyłączeniem starterów, ponieważ:
Właściwość polimerazy DNA:
- Polimeraza DNA wymaga wolnego końca 3'-OH (3'-hydroksylowego), do którego może dołączyć kolejny nukleotyd przez wiązanie fosfodiestrowe.
- Polimeraza NIE rozpoczyna syntezy "od zera" — nie potrafi utworzyć pierwszego wiązania na czystej, jednoniciowej matrycy bez punktu startu.
Rola startera:
- Starter = krótki (15-30 nukleotydów) fragment DNA komplementarny do określonego miejsca na matrycy.
- Po annealingu (przyłączeniu) starter daje wolny koniec 3'-OH na granicy z matrycą jednoniciową.
- Polimeraza DNA może chwycić ten koniec 3'-OH i kontynuować syntezę → wydłużanie nici komplementarnej do matrycy.
Wniosek: bez startera polimeraza nie miałaby "punktu zaczepienia" — synteza DNA nie mogłaby się rozpocząć. Startery definiują też specyficzne miejsce amplifikacji, ale zasady oceniania nie uznają odpowiedzi odnoszących się wyłącznie do specyficzności — trzeba wskazać, że polimeraza dołącza nukleotydy tylko do istniejącego odcinka łańcucha.
Pułapka 13.1 — odpowiedź "ATP" lub "GTP". To są rybonukleotydy (RNA), używane w transkrypcji + jako nośnik energii. W PCR (DNA) potrzeba deoksyrybonukleotydów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
Pułapka 13.2 — odpowiedź bez wskazania sposobu, np. „przez denaturację” albo „dzięki zmianom temperatury”. W standardowym PCR nici rozdziela się wysoką temperaturą (np. ok. 95 °C); zasady oceniania uznają też helikazę (PCR izotermiczny).
Pułapka 13.3 — odpowiedź "polimeraza nie umie się rozprostować". Klucz: precyzyjnie — polimeraza wymaga wolnego końca 3'-OH (do tworzenia wiązania fosfodiestrowego). Sama matryca jednoniciowa nie ma "wolnego końca" do tego.
Strona arkusza CKE z trescia zadania
Klucz pojęciowy — PCR
| Składnik | Funkcja |
|---|---|
| DNA matrycowy | Wzorcowy fragment DNA do amplifikacji |
| Startery (primery) | Krótkie fragmenty DNA (15-30 nt) komplementarne do końców pożądanego fragmentu |
| Polimeraza DNA | Taq polimeraza (z Thermus aquaticus) — termostabilna |
| Deoksyrybonukleotydy (dNTP) | dATP, dCTP, dGTP, dTTP — wszystkie 4! |
| Bufor | Optymalne pH + jony (Mg²⁺) dla enzymu |
| Termocykler | Urządzenie cykliczne zmieniające T (95→55→72°C) |
Klucz pojęciowy — cykl PCR
Etap 1 — Denaturacja (95°C, 30 sek):
- Wysokie T rozrywa wiązania wodorowe między komplementarnymi nićmi.
- Wiązania fosfodiestrowe (kowalencyjne) zachowane.
- Powstają 2 jednoniciowe DNA.
Etap 2 — Annealing przyłączenia starterów (50-65°C, 30 sek):
- T obniżona pozwala starterom związać się z komplementarnymi miejscami na niciach matrycowych.
- Każda nić matrycy chwyta jeden starter.
- Specyficzność wybiera konkretny fragment do amplifikacji.
Etap 3 — Elongacja syntezy DNA (72°C, 30 sek-2 min):
- Taq polimeraza wydłuża starter w kierunku 5’→3’.
- Dodaje dNTP komplementarne do matrycy.
- Powstaje nowa nić DNA komplementarna do matrycy.
Powtarzanie cyklu 25-40 razy → eksponencjalny wzrost liczby kopii.
- 1 cykl: 2 kopie z 1.
- 30 cykli: 2³⁰ = ~1 miliard kopii.
Mechanizm: dlaczego starter? (13.3)
Polimeraza DNA to enzym katalizujący tworzenie wiązania fosfodiestrowego między:
- 3’-OH istniejącej nici DNA (np. startera).
- 5’-fosforanem wolnego dNTP.
Kluczowy wymóg: musi być wolny 3’-OH do utworzenia wiązania. Polimeraza DNA NIE potrafi połączyć dwóch wolnych nukleotydów, czyli zacząć syntezy „od zera” — dołącza nukleotydy tylko do już istniejącego odcinka łańcucha.
Starter dostarcza wolny 3’-OH na końcu komplementarnym do matrycy → polimeraza “chwyta” + wydłuża.
To samo in vivo: replikacja DNA wymaga primazy (enzym RNA-polimerazy), która syntezuje krótki starter RNA → DNA-polimeraza go wydłuża. Później RNA jest usuwane + zastępowane DNA przez polimerazę.
Klucz pojęciowy — deoksyrybonukleotydy
| Nukleotyd | Składa się z | Komplementarny do (w matrycy) |
|---|---|---|
| dATP | deoksyadenozyna + 3 fosforany | T (timina) |
| dCTP | deoksycytydyna + 3 fosforany | G (guanina) |
| dGTP | deoksyguanozyna + 3 fosforany | C (cytozyna) |
| dTTP | deoksytymidyna + 3 fosforany | A (adenina) |
Wszystkie 4 są niezbędne — polimeraza dobiera do każdej pozycji matrycy nukleotyd komplementarny. Brak choćby jednego = zatrzymanie syntezy.
Punktacja CKE
- 13.1. 1 pkt — dATP + dCTP.
- 13.2. 1 pkt — rozdzielenie nici za pomocą wysokiej temperatury (podgrzania próbki) ALBO za pomocą helikazy.
- 13.3. 1 pkt — wskazanie wymogu polimerazy: wolny 3’-OH + funkcja startera.
- Suma: 3 pkt.
Po co to umieć
PCR opracował Kary Mullis (Nagroda Nobla z chemii 1993). Metoda pozwala z niewielkiej ilości DNA otrzymać w krótkim czasie bardzo wiele kopii wybranego fragmentu.
Zastosowania PCR:
- Diagnostyka chorób (np. COVID-19, HIV, HCV, HPV) — wykrywanie materiału genetycznego patogenów.
- Identyfikacja osób (testy ojcostwa, kryminalistyka).
- Klonowanie genów (amplifikacja konkretnego genu).
- Przygotowanie próbek do sekwencjonowania DNA.
- Kopalne DNA (np. mamut, neandertalczyk) — z fragmentów kości.
Taq polimeraza = klucz PCR:
- Termostabilna (działa w 72°C, przetrwa 95°C).
- Z Thermus aquaticus — termofilna bakteria z gorących źródeł Yellowstone.
- Dziś produkowana rekombinowana w E. coli, sprzedawana globalnie.
RT-PCR (Reverse Transcription PCR):
- Pierwszy krok: RNA → DNA przez odwrotną transkryptazę.
- Drugi krok: PCR (amplifikacja DNA).
- Używany w testach COVID (wirus SARS-CoV-2 to RNA).
- qPCR (Real-Time PCR) — pomiar amplifikacji w czasie rzeczywistym → ilościowy (jak dużo wirusa).
Limity PCR:
- Kontaminacja — ponieważ PCR powiela nawet niewielkie ilości DNA, zanieczyszczenie próbki obcym DNA może dać fałszywy wynik.
- Ograniczona długość powielanego fragmentu.
- Wymaga znajomości sekwencji fragmentów flankujących (do zaprojektowania starterów).
Rozumiesz, jak to rozwiązać?
Przećwicz podobne typy zadań w aplikacji
matury-online.pl ma tysiące zadań pogrupowanych po dziedzinach. Sprawdź, czy temat „biologia molekularna, PCR, polimeraza DNA, startery, deoksyrybonukleotydy, denaturacja” zrobisz samodzielnie.
Otwórz matury-online.pl